يُعدّ استخلاص الأحماض النووية الخطوة الأولى في بروتوكول تحضير عينات الجيل التالي من التسلسل. الأحماض النووية جزيئات حيوية كبيرة ضرورية لجميع أشكال الحياة المعروفة. تتكون من نيوكليوتيدات، وهي مونومرات تتكون من ثلاثة مكونات: سكر، وفوسفات، وقاعدة نيتروجينية. النوعان الرئيسيان من الأحماض النووية هما الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (RNA). سكر الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين هو الريبوز، بينما سكر الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين هو الريبوز منقوص الأكسجين.
رسم تخطيطي يوضح بنية الحمض النووي الريبوزي (RNA) (يسار) والحمض النووي الريبوزي (DNA) (يمين). اليوراسيل هو القاعدة المقترنة بالأدينين في الحمض النووي الريبوزي (RNA)، بينما الثايمين هو القاعدة المقترنة بالأدينين في الحمض النووي الريبوزي (DNA). حقوق الصورة: ويكيبيديا
أنواع استخلاص الأحماض النووية
استخلاص ثيوسيانات الغوانيدينيوم-فينول-كلوروفورم
بعد تعطيل البنية الخلوية للحمض النووي، يُستخدم إنزيما DNase وRNase لتعطيل النوكليازات الخلوية. بعد ذلك، يُمكن فصل الأحماض النووية المطلوبة عن بقايا الخلية.
الفينول وحده حمض كاربوليك قابل للاشتعال، ومسبب للتآكل، وسام. ولكن يمكن استخدام خليط من الفينول والكلوروفورم وكمية صغيرة من الأيزوأميل لاستخلاص الحمض النووي. عند إضافة الفينول والكلوروفورم إلى العينة، يتشكل مستحلب يحتوي على طبقة من الحمض النووي في الأعلى، نظرًا لطبيعته المحبة للماء. يمكن بعد ذلك جمع الحمض النووي وترسيبه بالطرد المركزي. ثم تُذاب حبيبات الحمض النووي الناتجة في الماء المعقم.
رسم تخطيطي يوضح خطوات استخلاص الفينول-كلوروفورم: إضافة خليط الفينول-كلوروفورم إلى مُحلل الخلايا، ثم الطرد المركزي، ثم الغسل بالماء للحصول على الحمض النووي المعزول. حقوق الصورة: إيفا ميزاروس، ٢٠٢١
يمكن بعد ذلك استخدام تقنية ثيوسيانات غوانيدينيوم-فينول-كلوروفورم لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA) في خطوة واحدة. يُفصل الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن الحمض النووي الريبوزي (DNA) بعد الاستخلاص باستخدام محلول حمضي يتكون من ثيوسيانات غوانيدينيوم، وأسيتات الصوديوم، والفينول، والكلوروفورم. يُسترد الحمض النووي الريبوزي (RNA) بالترسيب باستخدام الأيزوبروبانول، مما يُخلق بيئة حمضية تُبقي الحمض النووي الريبوزي (RNA) في أعلى الخليط.
الطرد المركزي المتدرج لكلوريد السيزيوم / بروميد الإيثيديوم
تم استخدام الطرد المركزي المتدرج لكلوريد السيزيوم / بروميد الإيثيديوم في مختبرات الأبحاث منذ عام 1950. تستغل الطريقة الكثافات المختلفة بين أيونات السيزيوم والماء، إلى جانب تداخل بروميد الإيثيديوم للتدخل في تكرار الحمض النووي والنسخ والإصلاح وإعادة التركيب.
يُعدّ الطرد المركزي المتدرج طريقةً معقدةً ومكلفةً وتستغرق وقتًا طويلاً مقارنةً ببروتوكولات العزل الأخرى. فهو يتطلب كميةً كبيرةً من العينات، وبالتالي فهو غير مناسبٍ لجميع أنواع التسلسل. كما أن بروميد الإيثيديوم ضارٌّ. لذلك، لا تُستخدم هذه الطريقة في المختبرات السريرية نظرًا لقيودها.
الاستخلاص في الطور الصلب
تتوفر تنقية الحمض النووي في الطور الصلب في معظم مجموعات الاستخلاص التجارية المتوفرة في السوق حاليًا. تُجرى هذه العملية عادةً باستخدام عمود دوران يعمل بقوة الطرد المركزي، مما يسمح بتنقية الحمض النووي بسرعة وكفاءة. يجب أولاً تهيئة العمود لامتصاص العينة، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام محلول منظم بدرجة حموضة معينة. بعد تفكيك الخلايا، تُمتص الأحماض النووية المطلوبة في العمود بسبب درجة حموضة محلول الربط. تُزال الملوثات بعد ذلك بالغسل باستخدام عامل تنافسي، ويُضاف الماء لتحرير الأحماض النووية المطلوبة من العمود.
التنقية القائمة على الخرز المغناطيسي
يُعتبر الفصل المغناطيسي الآن طريقةً بسيطةً وفعّالةً تُستخدم في تنقية الأحماض النووية. وهو تعديلٌ على الاستخلاص في الطور الصلب. تحمل الحبيبات شحنةً سطحيةً سالبةً، وترتبط انتقائيًا بالبروتينات، مثل الحمض النووي (DNA). قد يُساعد وضع مغناطيس على جانب الأنبوب أحيانًا في عملية الارتباط، حيث يُجمّع الجسيمات بالقرب من الجدار. يُمكن بعد ذلك سكب ما تبقى من العينة، والمكوّن من حطام خلوي ومواد غير مرغوب فيها. تُزال الأحماض النووية من الجسيمات المغناطيسية باستخدام محلولٍ عازل، وتُغسل أي ملوثات متبقية.
رسم تخطيطي يوضح بروتوكول التنقية باستخدام الخرز المغناطيسي. حقوق الصورة: أندرو جين، ٢٠١٩
لهذه الطريقة مزاياها بالتأكيد، فهي لا تتطلب عمليات طرد مركزي متكررة، أو ترشيحًا بالتفريغ، أو فصلًا عموديًا، مما يجعلها فعّالة من حيث الوقت والتكلفة. تتوفر العديد من مجموعات الأدوات التجارية، حتى أن بعض المصنّعين يدمجون الخرز المغناطيسي مع تقنيات استخلاص أخرى في الطور الصلب، بما في ذلك استخدام السيليكا. تساعد هذه التقنيات العلماء على تحسين استخلاص الحمض النووي باستخدام كميات صغيرة فقط من العينات.
Get Social